Análise de alto rendimento de precursores de aroma em cacau e café

O Dr. Vincent Lebot é um criador de plantas e geneticista no CIRAD (Centro Internacional de Cooperação em Recherche Agronomique, França) e emprega técnicas de separação cromatográfica, especialmente cromatografia planar instrumental, para selecionar híbridos de plantas tropicais melhorados geneticamente e variedades de quimiotipos adequados. HPTLC é sua técnica preferida por causa de seu baixo consumo de solvente e custos de operação e seu suporte a um alto rendimento de amostra.

Introdução
Estima-se que existam cerca de 24.000 variedades de cacau e mais de 30.000 variedades de café no mundo [1, 2]. Apenas algumas variedades foram avaliadas quanto à sua qualidade visando produtos especiais e aromáticos, o que é uma característica importante para garantir mercados, especialmente para pequenos proprietários em pequenos países produtores. Durante os processos de fermentação e secagem, os precursores do aroma presentes nos grãos verdes são transformados em compostos aromáticos determinando a qualidade dos grãos comerciais. A análise química de compostos não voláteis é, portanto, uma etapa essencial para a seleção de variedades com os traços de qualidade desejados. Alcalóides (teobromina e cafeína) e polifenóis (catequinas, proantocianidinas e antocianinas) contribuem para o sabor do cacau. A cafeína, a trigonelina e os ácidos clorogênicos são conhecidos por produzir sabor adstringente e ácido e amargo no café, mas muito poucas variedades foram comparadas em condições controladas. A sacarose também é um precursor do aroma no café e depende da variedade. Os objetivos deste estudo foram: i) desenvolver um protocolo para a quantificação de compostos não voláteis em cacau e café, ii) analisar e comparar variedades de cacau e café de diversas origens geográficas cultivadas em condições controladas e colhidas na maturidade plena.
Soluções padrão
Soluções estoque padrão de teobromina, trigonelina, cafeína, ideaina-3-O-galactosídeo, cianidina- 3-O-arabinosídeo, (-) - epicatequina, (-) - catequina, ácido clorogênico (CGA), ácido neoclorogênico (NCGA ou 5 Ácido -O-cafeoilquínico), ácidos 3,4-, 3,5-, 4,5-dicafeoilquínico e sacarose são preparados a 1,0 mg / mL com metanol. As soluções padrão são preparadas em diferentes níveis de concentração com metanol e armazenadas a 4 ° C.
 
Preparação de amostra
Os frutos do cacau e os frutos do café são colhidos à mão e colhidos seletivamente quando estão completamente maduros para garantir a uniformidade completa do material dos diferentes acessos. Todas as amostras são coletadas de uma única árvore saudável por base de acesso. Grãos verdes de cacau e café foram então secos em estufa a 60 ° C até peso constante (11% de umidade) e moídos. Para cada amostra de acesso, 10 g de pó são misturados em tubos de centrifugação com 30,0 mL de acetona para cacau e 30,0 mL de metanol - água 7: 3 (v / v) para café, sonicados por 10 min e depois centrifugados a 1.585 xg para 10 min. O sobrenadante é transferido para um frasco armazenado a 4 ° C no escuro até a análise.
Camada de cromatograma
São utilizadas placas de HPTLC de sílica gel 60 F254 (Merck) 20 x 10 cm.
 
Aplicativo de amostra
1,0 μL de soluções padrão e de amostra são aplicados como bandas com o amostrador automático TLC (ATS 4), comprimento de banda 8,0 mm, distância da borda esquerda 15,0 mm, distância da trilha 8,9 mm.
 
Cromatografia
As placas são desenvolvidas na Câmara de Revelação Automática (ADC 2) com acetato de etila - tolueno - ácido fórmico - água 7: 1: 1: 1 (v / v) sem saturação da câmara para extratos de cacau e com acetato de etila - diclorometano - ácido fórmico - ácido acético - água 23: 6: 2: 2: 2 (v / v) com saturação da câmara (10 min, com papel filtro) para extratos de café, a uma distância de migração de 70,0 mm. Para a sacarose, as placas são desenvolvidas com acetonitrila - água 87:13 (v / v) sem saturação da câmara a uma distância de migração de 85 mm.
 
Documentação
As imagens das placas são capturadas com o TLC Visualizer em UV 254 nm e UV 366 nm e em luz branca após derivatização.
 
Densitometria
Medição de absorvância a 275 nm e 330 nm antes da derivatização e para sacarose a 520 nm após derivatização com TLC Scanner 4 e winCATS, dimensão da fenda 8,00 mm x 0,20 mm, velocidade de varredura 50 mm / s.
 
Nota do Editor: Um comprimento de fenda de 5,00 mm é geralmente usado para um comprimento de banda de 8,00 mm.
 
Derivação
A placa é imersa em reagente anisaldeído (para proantocianidinas) ou reagente ácido anilina-difenilaminafosfórico (para sacarose) com o dispositivo de imersão do cromatograma e aquecido no aquecedor de placa TLC a 105 ° C por 10 min.
Resultados e discussão
Para avaliação da precisão da repetibilidade, faixas lineares foram calculadas usando o método dos mínimos quadrados. A repetibilidade foi confirmada pela aplicação de quatro repetições de cada padrão em cinco níveis de concentração diferentes (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 μg / μL) e a variância entre as repetições foi expressa como o desvio padrão da repetibilidade (% RSD) [3]. As medições da área do pico foram comparadas aos padrões individuais e os valores correspondentes foram quantificados em mg / g de peso seco [3]. A repetibilidade das medições de HPTLC foi avaliada para cada padrão individual e os gráficos de calibração foram lineares para todos os padrões analíticos com todos R2> 0,99 (P = 0,01). Para cada composto, os valores de% RSD foram baixos (<3,5%), indicando que as medições de HPTLC são precisas o suficiente para serem usadas para quantificação.
 
A análise multivariada de compostos não voláteis (via áreas de pico obtidas por densitometria de varredura) em 137 variedades de cacau claramente discrimina os diferentes grupos de variedades (Amenolado, Criollo, Forastero, Trinitario). A teobromina foi o composto mais importante em todos os acessos analisados, seguida da cafeína, epicatequina / catequina, cianidina e ideaína. A proantocianidina B2 também foi importante e quatro outras proantocianidinas eram compostos menores [3]. As 108 variedades de café analisadas foram claramente diferenciadas com base no teor de cafeína, que está significativamente correlacionado com os ácidos clorogênicos. As variedades de arábica apresentam baixo teor de cafeína. Sacarose, trigonelina, cafeína e oito ácidos clorogênicos foram detectados e quantificados com base nos valores de RF dos padrões e combinando seus espectros de UV com os das amostras [3]. A análise de componentes principais (PCA) das variedades de café mostra que 73,2% da variação total é explicada pelos eixos 1 e 2. C. arabica é caracterizada por baixos teores de alcalóides e CGAs e está localizada principalmente no lado esquerdo do eixo 1, enquanto C. canephora caracterizada por altos alcalóides e conteúdos de CGAs estão localizados no lado direito do eixo 1.C. arábica com <11 mg / g de cafeína está na extremidade esquerda do eixo 2 e C. canephora com> 18 mg / g de cafeína está na extremidade direita do eixo 2. Mais resultados e detalhes estão disponíveis em [3].

Pode consultar o artigo completo aqui
https://www.camag.com/article/high-throughput-analysis-aroma-precursors-cocoa-and-coffee
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