Usar Raman de alto rendimento para monitorizar alterações estruturais de proteínas: a promessa para testes em tempo real

INTRODUÇÃO
O mercado de anticorpos monoclonais (MAbs) está projetado para atingir um valor de US$ 350 bilhões até o final de 20271. Portanto, o interesse em otimizar as práticas de produção é de grande interesse devido a um valor financeiro tão substancial. Uma das principais áreas-alvo para otimização é o processamento downstream (DSP). DSP refere-se à recuperação e purificação de produtos farmacêuticos biossintéticos de fontes naturais, como um caldo de fermentação. A produção e purificação de MAbs particularmente pode ser um desafio, pois essas moléculas são propensas a vários tipos de modificações pós-tradicionais que podem reduzir sua eficácia e limitar sua vida útil. As modificações mais prevalentes incluem glicosilação, dobragem incorreta, agregação, oxidação, desamidação e proteólise. Algumas delas podem ser desejáveis, ou mesmo necessárias, como a glicosilação. No entanto, a maioria dos comportamentos listados são prejudiciais à constituição do produto final.
Sensores para parâmetros como pH, condutividade, pressão e densidade ótica são comuns na monitorização da purificação de MAb. A espectroscopia UV de comprimento de onda único também é amplamente implementada nesses processos de purificação. Os dados desses sensores são limitados e não podem fornecer informações sobre a concentração específica do produto, impurezas ou modificações pós-tradicionais. A Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) é frequentemente usada para obter essas informações, mas o tempo necessário para a preparação e análise da amostra impede que seja usada para análise em tempo real. Isso é significativo porque a análise em tempo real é altamente desejável, pois abre as portas para a possibilidade de liberação em tempo real. O teste de libertação em tempo real (RTRT), por sua vez, promete maior eficiência de produção, redução de custos e aumento da lucratividade.
A espectroscopia Raman tem demonstrado ser uma técnica que pode detetar e monitorizar alterações na estrutura secundária de proteínas. A desnaturação e a má dobragem de proteínas são importantes excursões e desvios do processo que são o resultado de mudanças estruturais indesejadas no bio terapêutico de interesse. Para demonstrar o Tornado HyperFlux™ PRO Plus (HFPP) e a sua capacidade de detetar esses tipos de alterações na estrutura da proteína, perturbamos a estrutura do Citocromo C (CytC) com concentrações crescentes de LiCl. A desnaturação de CytC por LiCl demonstrou induzir alterações no grupo heme de CytC4,5. Com a antecipação de mudanças estruturais na presença de LiCl, valeu a pena determinar se o Raman poderia detetar essas mudanças no contexto do caso de uso de DSP, fornecer informações moleculares de diagnóstico.
 
EXPERIÊNCIA E ANÁLISE DE DADOS
Parâmetros de monitorização de desnaturação – Para desnaturar e induzir alterações na estrutura do heme de CytC, foi adicionado LiCl sólido (Sigma Aldrich) em 4 x 0,5 g adições a uma solução de 1,25mg/mL CytC em um tampão de fosfato de sódio 25 mM e 150 mM NaCl a um pH de 7,5. A concentração final de LiCl foi de 4,2 M. As alterações induzidas em CytC por LiCl foram analisadas usar o sistema HFPP equipado com uma sonda padrão num conjunto de célula de fluxo. A coleta espectral foi realizada por 45 segundos (exposições de 3 segundos x 15 médias). Os dados foram recolhidos diretamente durante um processo de fluxo de líquido usar soluções de CytC desnaturado e nativo.
Preparação de amostras para modelagem quantitativa - Para amostras nativas de CytC, um conjunto de calibração de 0-1,70 mg/mL foi preparado e medido com um tempo de integração efetivo de 45 segundos (3000ms x 15 médias). Um conjunto de amostras semelhante foi feito com o CytC desnaturado com 4,2 M LiCl (também 0-1,70 mg/mL) e medido com o mesmo tempo de integração. A análise espectral 2D COS foi realizada usar Python (pacotes SciPy, NumPy e Matplotlib) e calibrações quimiométricas foram feitas com PeaXact™ da S-Pact.
RESULTADOS
 
Para verificar se a espectroscopia Raman poderia ser usada para observar alterações induzidas em CytC por LiCl, foi realizada análise de espectroscopia de correlação 2D (2D COS) para investigar o comportamento dos espectros Raman de CytC em resposta às adições de LiCl. 2D COS compara quantitativamente a intensidade espectral em dois números de onda ν1 e ν2 juntamente com perturbação6. Se o sinal de um pico cruzado em um par de coordenadas espectral (ν1, ν2) de um espectro de correlação síncrona 2D for positivo, isso significa que as intensidades desses picos estão a aumentar ou diminuir na mesma direção. Vice-versa, se o pico cruzado for negativo, então as intensidades desses picos pareados estão a mudar em direções opostas7.
Relatado na Figura 1 é o espectro síncrono que fornece informações sobre quais picos estão a mudar simultaneamente com a perturbação gradual do LiCl. Os espectros foram pré-processados com 1ª derivada (suavização de Savitzky-Golay de 21 pts) e Variado Normal Padrão (SNV) com um subconjunto de regiões de 1530-1650 cm-1. A banda de 1558 cm-1 que corresponde ao estiramento simétrico Cβ-Cβ do esqueleto heme de CytC8 correlaciona-se positivamente com as regiões 1630-1648 cm-1 (estiramento simétrico Cα-Cm do esqueleto Heme, folha beta) e 1648-1667 cm -1 (alfa-hélices, espiras, estrutura secundária desordenada da proteína)9. Isso confirma a perturbação das características estruturais de ordem superior de CytC pela presença de LiCl.
A Figura 2 mostra a banda heme de 1558 cm-1 à medida que LiCl é adicionado à solução de proteína. A redução da banda em função do LiCl adicionado é aparente. A Figura 3 exibe os espectros de CytC desnaturado conforme as concentrações foram aumentadas de 0-1,7 mg/mL, enquanto a Figura 4 exibe os espectros de CytC nativo conforme as concentrações foram aumentadas de 0-1,7 mg/mL. As tendências do sinal Raman no aumento do teor de proteína são visualmente identificáveis e são distintas entre o nativo e o CytC desnaturado. Isso confirma ainda que a espectroscopia Raman de alto rendimento pode distinguir prontamente entre CytC nativo e desnaturado com base em alterações na estrutura de ordem superior. Isso implica o potencial de detetar e quantificar as excursões do processo, como a desnaturação durante o DSP, visar o RTRT.
 
As estratégias de liberação em tempo real podem fornecer muito valor para as organizações de fabricação farmacêutica. Os benefícios podem incluir estoque reduzido, custos laboratoriais reduzidos e ROI aumentado. A medição de CQAs e excursões durante a fase de fabricação de DSP podem levar ao RTRT. A avaliação em tempo real de alterações conformacionais de proteínas, desnaturação, agregação e outras modificações pós-tradicionais estão entre os parâmetros de interesse no contexto do RTRT. A deteção dessas modificações em um cenário de DSP traria valor significativo e impulsionaria o objetivo de criar RTRT para drogas terapêuticas de proteínas.
Nesta nota de aplicativo, o Tornado Hyperflux™ PRO Plus foi usado para demonstrar que as alterações espectrais podem ser observadas com a perturbação da estrutura da proteína do Citocromo C. Essas alterações espectrais provavelmente envolveram a deteção de desnaturação e rutura estrutural de ordem superior. Este é um tipo de excursão importante que deve ser monitorada e pode ser detetada por um dispositivo Raman de alto desempenho, como o Tornado HFPP. Há abundante literatura10,11,12 confirmar o fato de que o monitoramento em tempo real de estruturas secundárias de proteínas é possível com espectroscopia Raman.
Os espectrômetros HTVS™ da Tornado fornecem o máximo benefício fornecido pelo Raman para DSP e fornecem o maior potencial de uso.

Mais informação aqui
https://tornado-spectral.com/using-raman-monitor-protein-structural-changes/
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